在PCR操作過程中應(yīng)注意哪些?

健康 未結(jié) 3 837
王程龍
王程龍 2021-08-09 17:55
3條回答
  • 2021-08-09 18:06

    1:避免交叉污染——勤換槍頭和高壓槍頭和PCR管。
    2:引物設(shè)計(jì)要正確,選擇可靠的生物公司合成引物,如果公司不好,給的引物會(huì)不出結(jié)果
    3:DNA提取要成功。
    4:引物和模板和體系所加的比例要合適,模板過量會(huì)抑制體系的反應(yīng)。
    5:跑膠時(shí)注意區(qū)分開EB污染區(qū)和清潔區(qū)。
    6:吸取試劑前不必每次都混勻,離心是為了把粘在壁上和蓋上的試劑離下來。不離也沒關(guān)系,可以直接用槍頭吸。但是配制的時(shí)候需要充分混勻,比如溶解引物,需要先混勻再分裝。
    7:DNA提取之后最好4度過夜之后再做PCR,這有利于DNA的充分溶解。
    大家再來補(bǔ)充
    0 討論(0)
  • 2021-08-09 18:09

    1、PCR實(shí)驗(yàn)一定要保管好試劑,防止交叉污染,尤其是ddH2O2的交叉使用,極易引起污染。
    2、NA處理最好用硅烷化塑料管以防粘附在管壁上,所有緩沖液吸頭、離心管等用前必須高壓處理,常規(guī)消耗用品用后作一次性處理,避免反復(fù)使用造成污染。
    3、PCR在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行,操作前后紫外燈消毒。
    4、超凈臺(tái)內(nèi)設(shè)內(nèi)供PCR用微量離心機(jī)、一次性手套、整套移液器和其它必須品;移液品用一次性吸頭和活塞的正向排液器,防止移液器基部污染。
    5、PCR操作應(yīng)戴手套并勤于更換。成套試劑,小量分裝,專一保存,防止它用。配制試劑用新器具,用后作一次性處理。
    6、試劑管用前先瞬時(shí)離心(10s),使液體沉于管底,減少污染手套與加樣器機(jī)會(huì)。
    7、最后加模板DNA(包括在石蠟油后),馬上蓋好,混勻,瞬時(shí)離心(10s),使水相與有機(jī)相分開。加入模板且忌噴霧污染,所有非即用管都應(yīng)蓋嚴(yán)。加模板DNA后應(yīng)更換手套。
    8、引物稀釋時(shí),要首先瞬時(shí)離心,以避免粉末狀引物在開蓋時(shí)彈出管外。
    9、實(shí)驗(yàn)設(shè)陽性、陰性對照。
    0 討論(0)
  • 2021-08-09 18:15

    要注意的問題太多了,
    首先,在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí),結(jié)構(gòu)要好,長度應(yīng)在20bp左右,避免引物間形成引物二聚體。兩條引物的退火溫度盡量保持一致,最好是在55度左右。
    其次,使用的DNA模板量是比較關(guān)鍵的,應(yīng)使用純度較高,基因組較完全,沒有產(chǎn)生斷鏈的基因組DNA。
    然后是PCR體系中各個(gè)試劑的使用,比如說酶的純度,活性,并且要注意酶量一定要適中,各DNTP的量要保持一致。
    最后是PCR程序的設(shè)置。如果怕一開始就使用一個(gè)固定的退火溫度擴(kuò)增不出來,可以先小批量得試驗(yàn)溫度梯度,或者用touchdown程序,即先設(shè)置一個(gè)較高的退火溫度,這樣引物的特異性結(jié)合會(huì)比較好,然后每個(gè)循環(huán)的退火溫度都比上個(gè)循環(huán)低0.5度或1度,最終停留在某一個(gè)較合適的溫度完成整個(gè)程序。
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